Hodowla komórkowa jest jednym z najważniejszych narzędzi stosowanych w biologii komórkowej i molekularnej, dostarczając doskonałego systemu modelowego do badania normalnej fizjologii i biochemii (np. badania metaboliczne, starzenie), wpływu leków i związków toksycznych na komórki, a także wpływu mutagenezy i kancerogenezy komórek. Jest również stosowany w badaniach przesiewowych i opracowywaniu leków oraz w produkcji na dużą skalę związków biologicznych (np. szczepionek, białek terapeutycznych). Główną zaletą stosowania hodowli komórkowej do dowolnego z tych zastosowań jest spójność i powtarzalność wyników, które można uzyskać przy użyciu partii klonalnych komórek.
Hodowlę komórkową
Hodowla komórkowa odnosi się do usuwania komórek ze zwierząt lub roślin i ich wzrostu w sprzyjającym sztucznym środowisku. Komórki mogą być pobierane bezpośrednio z tkanki i dysocjowane enzymatycznie lub mechanicznie przed hodowlą lub mogą pochodzić z ustalonych linii komórkowych lub szczepów
1. Szkolenie podstawowe
Hodowla pierwotna odnosi się do etapu hodowli po wyizolowaniu komórek z tkanki i namnażaniu w odpowiednich warunkach, aż zajmą cały dostępny substrat (tj. osiągną konfluencję). Na tym etapie komórki należy poddać hodowli wtórnej (tj. pasażowaniu) poprzez przeniesienie ich do nowego pojemnika ze świeżą pożywką wzrostową, aby zapewnić więcej miejsca na dalszy wzrost.
2. Linie komórkowe
Po pierwszej podhodowli, kultury pierwotne nazywane są liniami komórkowymi lub subklonami. Linie komórkowe pochodzące z hodowli pierwotnych mają skończoną długość życia (tj. są skończone), a kiedy są pasażowane, przeważają komórki o najwyższym potencjale wzrostu, co skutkuje pewnym stopniem jednorodności genotypowej i fenotypowej płci w populacji.
3. Linie komórkowe
Linia komórkowa staje się szczepem komórkowym, jeśli subpopulacja linii komórkowej jest aktywnie wybierana z hodowli przez klonowanie lub innymi metodami. Linie komórkowe często uzyskują dodatkowe zmiany genetyczne po zainicjowaniu linii rodzicielskiej.
4. Ograniczone linie komórkowe i ciągłe linie komórkowe
Normalne komórki zwykle dzielą się tylko ograniczoną liczbę razy, zanim stracą zdolność do proliferacji, co jest uwarunkowanym genetycznie zdarzeniem zwanym starzeniem; te linie komórkowe nazywane są skończonymi. Jednak niektóre linie komórkowe stają się nieśmiertelne w procesie zwanym transformacją, który może zachodzić spontanicznie lub być indukowany chemicznie lub wirusowo. Skończona linia komórkowa staje się ciągłą linią komórkową, gdy przechodzi transformację i uzyskuje zdolność do dzielenia się w nieskończoność.
Linie komórkowe hodowane w sposób ciągły są podatne na dryf genetyczny, skończone linie komórkowe są skazane na starzenie się, wszystkie hodowle komórkowe są podatne na zanieczyszczenie mikrobiologiczne, a awaria sprzętu może wystąpić nawet w najlepiej zarządzanych laboratoriach. Ponieważ ustalone linie komórkowe są cennym zasobem, którego wymiana jest kosztowna i czasochłonna, niezbędne jest ich kriokonserwacja w celu długoterminowego przechowywania.
Po uzyskaniu niewielkiej liczby pozostałych komórek z podhodowli należy je zamrozić jako materiał posiewowy i zabezpieczyć przed ogólnym zastosowaniem laboratoryjnym. Zapasy robocze można przygotować i uzupełnić z zamrożonych zapasów nasion. Jeśli zapas nasion jest wyczerpany, wówczas zamrożony materiał roboczy można wykorzystać jako źródło do przygotowania świeżego materiału siewnego, dając minimalny wzrost ilości od początkowego zamrożenia.
Najlepszym sposobem kriokonserwacji hodowanych komórek jest ciekły azot, w pożywce pełnej, w obecności krioprotektantów, takich jak sulfotlenek dimetylu (DMSO) lub glicerol. Krioprotektanty obniżają temperaturę zamarzania pożywki, a także zmniejszają szybkość chłodzenia, znacznie zmniejszając ryzyko tworzenia się kryształków lodu, które mogą uszkodzić komórki i doprowadzić do ich śmierci.
Wiadomo, że DMSO ułatwia wnikanie cząsteczek organicznych do tkanek. Podczas obchodzenia się z odczynnikami zawierającymi sulfotlenek dimetylu należy stosować sprzęt i procedury odpowiednie do zagrożeń związanych z tym materiałem. Utylizować odczynniki zgodnie z lokalnymi przepisami.
Hoduj komórki z zamrożonych zapasów komórek roboczych
Pamiętaj, aby wypełnić dziennik bankowości mobilnej
Określ liczbę pasaży, np. jeśli poprzednie komórki były zamrażane i były rozmrażane trzy razy, proces rozmrażania byłby czwartym pasażem.
Dodać pożywkę wzrostową (pożywkę minimalną, surowicę cielęcą i antybiotyki) do kolb T75 oznaczonych linią komórkową, numerem pasażu i datą
Umieść kolbę poziomo w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni i 5% CO2 na co najmniej 15 minut. To ogrzeje pożywkę i doprowadzi ją do normalnego pH (7.0-7.6)
Rozmrozić zamrożone fiolki z liniami komórkowymi w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni z delikatnym mieszaniem. Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, utrzymuj o-ring i nasadkę nad poziomem wody (2-5 minut).
Umieść fiolkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2). Aby uniknąć zanieczyszczenia, przed otwarciem fiolki przetrzyj ją 70-procentowym etanolem.
Przenieść zawartość kolby z zamrożonymi komórkami do kolby T75 zawierającej pożywkę wzrostową. Wymieszaj i delikatnie potrząśnij kolbą, aby równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchni kolby.
Inkubować kolbę przez noc w inkubatorze CO2 w 37 stopniach z 5% CO2. Pozwól komórkom przyczepić się przez noc
zmieniające się podłoże wzrostu
Inkubuj kolbę przez dodatkowe 2-4 dni w temperaturze 37 stopni, 5 procent CO2 i obserwuj, aż komórki rosną
Gdy komórki osiągną w przybliżeniu 90 procent konfluencji, zapas komórek można rozszerzyć przy użyciu kolby T150
