Jak wszyscy wiemy, typy komórek hodowanych w laboratorium można z grubsza podzielić na dwa typy: komórki adherentne i komórki zawiesinowe, aw obu stanach istnieje tylko kilka rodzajów komórek.
Komórki zawiesinowe odnoszą się do rodzaju komórek, które mogą rosnąć w stanie zawieszonym w pożywce bez polegania na podłożach, takich jak limfocyty i większość komórek pochodzących z układu krwionośnego. (takie jak mysie komórki białaczkowe WEHI-3, ludzkie komórki białaczkowe K-562, HL-60). W przemyśle coraz więcej komórek adherentnych zostało udomowionych i hodowanych w pełnej zawiesinie. Obecnie komórki SP2/0, NS{6}}, CHO, BHK i HEK293 są wykorzystywane głównie w przemyśle i są wykorzystywane głównie do produkcji białek rekombinowanych; komórki pasażowe powszechnie stosowane w biologicznych produktach weterynaryjnych obejmują głównie komórki BHK21 hodowane w pełnej zawiesinie, komórki MDCK; i komórki Vero, komórki PK, komórki ST, komórki Marc145 itp. przy pomocy hodowli zawiesinowej mikronośnika, każda komórka ma inną charakterystykę.
Komórki zawiesinowe
Komórki zawieszenia „thp-1” 200x
Ogólnie, komórki zawiesinowe są łatwiejsze w obróbce niż komórki adherentne, ponieważ do pasażowania komórek zawiesinowych nie jest wymagana trypsynizacja. Nie oznacza to jednak, że komórki zawiesinowe są łatwiejsze w hodowli niż komórki adherentne. Dla nowicjuszy jest to trudniejsze. Zawsze pojawiają się różne problemy: na przykład, dlaczego zawsze pojawiają się martwe komórki i różnicowanie komórek; zgadza się, że przejście jest łatwe, ale wynikiem będzie zróżnicowanie; problemy pojawiają się ponownie po kriokonserwacji i rekonwalescencji!
Następnie omówmy kilka kluczowych punktów dotyczących hodowli komórek zawiesinowych~
Punkt 1: Dosyć cierpliwości, jest bardzo potrzebna
Wiele komórek zawiesinowych ma stosunkowo słabą żywotność, gdy są właśnie odzyskiwane z kriokonserwacji. W tej chwili musimy uzbroić się w cierpliwość, aby poczekać, aż komórki zakończą samonaprawę i wejdą w fazę wzrostu logarytmicznego. Na przykład THP-1 (ludzka białaczka monocytowa) często potrzebuje 7-10 dni okresu regeneracji od rozmrożenia do normalnej proliferacji; Jurkat, klon E6-1 (komórki ludzkiej białaczki limfocytowej T) również potrzebują 5-7 dni po wyzdrowieniu. Powrót do stanu sprzed zamrożenia. Nowicjusze mogą w tym okresie zrezygnować z treningów, więc prosimy o więcej cierpliwości! Kultywowanie takich komórek jest również procesem kultywowania cierpliwości!
Punkt 2: Chwyć gęstość inokulacji
Ogólnie rzecz biorąc, gęstość komórek zawiesinowych nie powinna być mniejsza niż 500,000/ml. Wiele komórek zawiesinowych jest zależnych od gęstości, a brak proliferacji spowodowany niską gęstością jest również jednym z powszechnych problemów nowicjuszy. Oczywiście istnieje bardzo niewiele komórek, których stan pogarsza się, gdy gęstość jest wysoka, na przykład W6/32 (mysie komórki hybrydomy B). Dlatego bardzo ważne jest, aby przed hodowlą nieznanych komórek szukać odpowiednich informacji, aby uchwycić cechy komórek. Tylko znając siebie i wroga, możesz wygrać wszystkie bitwy!
Częstotliwości wymiany pożywki nie należy ograniczać do „wyraźnie”. Komórki to żywe istoty. Podczas ciągłego cyklu hodowli można kilka razy dodawać określone składniki odżywcze, takie jak pożywka uzupełniająca i glukoza, w zależności od stanu wzrostu komórek, aby utrzymać dobry stan wzrostu komórek. . Podczas procesu hodowli zawiesinowej, wraz z namnażaniem się komórek, zużyciem składników odżywczych w pierwotnej pożywce i wzrostem metabolitów, żywotność komórek będzie się zmniejszać, a terminowe uzupełnianie składników odżywczych sprawi, że komórki będą we względnie dobrym środowisku do życia. Nie będę tutaj wchodził w szczegóły i unikał częstego wirowania i wymiany płynu.
Porozmawiajmy o metodzie wymiany płynu:
①Metoda odśrodkowej pełnej wymiany cieczy
Oznacza to, że usuń całą starą pożywkę przez odwirowanie (800-1000rpm, 5 min) i zastąp ją świeżą pożywką. Ta metoda jest odpowiednia do zastąpienia pożywki dobrze rozwiniętymi komórkami zawiesinowymi o „twardej skórce” (takimi jak K562) lub w obecnej sytuacji, gdy komórki są w dobrym stanie, a gęstość jest wysoka, co skutkuje dużym zużyciem pożywki. Zaletą tej metody jest to, że pożywkę zmienia się dokładnie i można usunąć część resztek komórkowych, ale spowoduje to również pewien stopień mechanicznego uszkodzenia komórek.
②Odśrodkowa metoda półwymiany
Oznacza to, że odwirowując (800-1000rpm, 5min) 50-procentową zawiesinę komórek, zastąp 50-procentową objętość świeżej pożywki. Ta metoda jest odpowiednia do porównywania „obłudnych” komórek trudnych do hodowli (takich jak thp{6}}) lub sytuacji, w których gęstość jest niska, ale należy usunąć więcej zanieczyszczeń w stanie dostosowania.
③ Metoda wymiany cieczy sedymentacyjnej
Oznacza to, że zamiast stosowania wirówki stosuje się metodę naturalnej sedymentacji grawitacyjnej w celu oddzielenia pożywki od komórek, tak aby zastąpić całość lub część świeżej pożywki. Ma jednak ograniczenia zastosowania — nadaje się tylko do komórek, które mogą tworzyć skupiska komórek o określonej wielkości (w przeciwnym razie nie mogą się one osadzać w sposób naturalny i można je wirować tylko z niską prędkością), zwłaszcza w przypadku komórek, których proliferacja opiera się na agregacji komórek , np. NK-92, NK- 92 MI, Jurkat. Ta metoda może zminimalizować uszkodzenia mechaniczne spowodowane procesem wirowania podczas procesu wymiany cieczy, przy jednoczesnym zachowaniu zagregowanej masy komórkowej, a usuwanie resztek komórkowych jest stosunkowo dokładne.
Po opanowaniu powyższych punktów oraz dobrych nasion komórek, tuż za rogiem jest wyhodowanie „pięknych” komórek zawiesinowych!
płytka do hodowli komórkowej
Płytki Yongyue Medical w kształcie litery U do hodowli komórek są najczęściej używane do hodowli komórek zawiesinowych przy użyciu polistyrenu medycznego (PS), wyprodukowanego w warsztacie oczyszczania na 100,{2}}poziomach, wysterylizowane przez napromieniowanie, wolne od DNaz, RNaz i pirogenów -bezpłatny , Bezpieczeństwo i ochrona środowiska.
Płytki do hodowli komórkowych są dostępne w różnych specyfikacjach, aby zaspokoić potrzeby różnych kultur bakteryjnych. Typy produktów są podzielone na 6-dobrze, 12-dobrze, 24-dobrze, 48-dobrze, 96-dobrze i 384-dobrze, z który 96-dołek dzieli się na dno płaskodenne, dno w kształcie litery U, dno w kształcie litery V; Płytki hodowlane w kształcie litery U są najczęściej używane do hodowli komórek zawiesinowych; Płytki hodowlane w kształcie litery V są najczęściej używane do immunologicznych eksperymentów hemaglutynacji.