Technologia PCR musi mieć sztucznie zsyntetyzowane rozsądne startery i wyekstrahować próbki DNA, a następnie wykonać automatyczne cykle termiczne, a na koniec przeprowadzić identyfikację i analizę produktu. Obecnie projektowanie i syntezę podkładów można przeprowadzić tylko w kilku instytutach badawczych, instytutach i klinikach o dużej sile technicznej. Aplikacja wymaga jedynie zakupu zestawu do wykrywania PCR, aby rozpocząć pracę. Istnieje wiele czynników wpływających na automatyczny cykl termiczny PCR. W przypadku różnych próbek DNA ilość różnych składników dodanych w reakcji PCR oraz parametry cyklu temperaturowego są niespójne.
Kilka głównych czynników wpływających zostało wprowadzonych w następujący sposób.
Jeden, parametry cyklu temperaturowego
W automatycznym cyklu termicznym PCR najważniejszym czynnikiem jest temperatura denaturacji i wyżarzania. Jak pokazano na przykładzie operacji, warunki denaturacji, wyżarzania i wydłużania to: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, łącznie cykl 25～30 A, amplifikowany fragment ma wielkość 500 pz. Tutaj należy obliczyć czas każdego etapu po osiągnięciu przez mieszaninę reakcyjną wymaganej temperatury. W automatycznym termocyklerze czas od pierwotnej temperatury mieszaniny do wymaganej temperatury wynosi 30-60s. Długość tego opóźnienia zależy od kilku czynników, m.in. typu rury reakcyjnej, grubości ścianki, objętości mieszaniny reakcyjnej, ciepła źródła (łaźnia wodna lub blok grzejny) oraz różnica temperatur między tymi dwoma etapami, które powinny być odpowiednio podane podczas ustawiania cyklu termicznego Należy zwrócić uwagę i rozważyć, a rzeczywisty pomiar należy przeprowadzić na każdym przyrządzie.
Inną ważną kwestią dotyczącą czasu cyklu termicznego jest odległość między dwoma podkładami; im większa odległość, tym dłużej trwa synteza pełnej długości sekwencji docelowej. Podany powyżej czas reakcji opiera się na optymalnej długości syntezy 500 pz. Sporządzono sekwencję docelową. Oto wstęp do doboru różnych temperatur.
1. Temperatura denaturacji matrycy Temperatura denaturacji określa temperaturę, w której dwuniciowy DNA topi się w reakcji PCR. Jeśli temperatura denaturacji nie zostanie osiągnięta, nie zostanie wytworzona jednoniciowa matryca DNA i PCR nie rozpocznie się. Niska temperatura denaturacji oznacza niepełną denaturację, dwuniciowe DNA. Szybko się renaturuje, zmniejszając w ten sposób wydajność. Ogólnie 90～95℃. Gdy próbka osiągnie tę temperaturę, należy ją szybko schłodzić do temperatury wyżarzania. Denaturacja DNA zajmuje tylko kilka sekund i nie jest konieczna przez długi czas; wręcz przeciwnie, powinieneś starać się jak najlepiej w wysokiej temperaturze. Skróć go, aby utrzymać aktywność polimerazy Taq DNA. Maksymalna temperatura denaturacji po dodaniu polimerazy Taq DNA nie powinna przekraczać 95°C.
2. Temperatura hybrydyzacji startera Temperatura hybrydyzacji określa specyficzność i wydajność PCR; jeśli temperatura jest wysoka, swoistość jest silna, ale jeśli temperatura jest zbyt wysoka, starter nie może być trwale połączony z matrycą i wydajność amplifikacji DNA jest zmniejszona; temperatura jest niska, wydajność jest wysoka, ale zbyt niska może powodować niedopasowanie startera i matrycy, wzrost produktów niespecyficznych. Ogólnie rzecz biorąc, zacznij od warunków reakcji 37 ℃, skonfiguruj serię reakcji kontrolnych, aby określić optymalną temperaturę wyżarzania dla określonej reakcji. Można to również wywnioskować na podstawie zawartości (G+C)% podkładów do uchwycenia testu Punktem wyjścia testu ogólnego, temperatura wyżarzania Ta (temperatura wyżarzania) jest o 5 ℃ niższa niż temperatura topnienia TTm (temperatura topnienia) startera amplifikacyjnego, którą można obliczyć według wzoru:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Wśród nich A, T, G i C odpowiednio reprezentują liczbę odpowiednich zasad. Na przykład, dla podkładu o 20 zasadach, jeśli zawartość (G+C)% wynosi 50%, punkt początkowy Ta można ustawić na 55°C. Przy typowym stężeniu gruntu (takim jak 0,2 μmol/L) reakcja wyżarzania może zostać zakończona w ciągu kilku sekund i długotrwałe wyżarzanie nie jest konieczne.
3. Wybór temperatury wydłużania startera zależy od optymalnej temperatury polimerazy Taq DNA. Generalnie 70～75℃, standardowa szybkość katalizowanych enzymów nukleotydów przy 72℃ może osiągnąć 35～100 nukleotydów/s. na minutę. Długość 1kb można wydłużyć, a jej szybkość zależy od składu roztworu buforowego, wartości pH, stężenia soli i charakteru matrycy DNA. Jeśli amplifikowany fragment jest krótszy niż 150 pz, etap wydłużania można pominąć i staje się on cyklem dwutemperaturowym, ze względu na Taq DNA. Polimeraza wystarcza do zakończenia syntezy krótkich sekwencji w temperaturze hybrydyzacji. W przypadku krótkich fragmentów sekwencji o wielkości od 100 do 300 pz efektywne jest zastosowanie szybkiego i prostego cyklu w dwóch temperaturach. W tym czasie temperatura wydłużania gruntu jest taka sama jak temperatura wyżarzania. W przypadku fragmentów DNA powyżej 1 kb czas wydłużania można kontrolować w ciągu 1 do 7 minut w zależności od długości fragmentu. Jednocześnie do buforu PCR należy dodać żelatynę lub odczynnik BSA, aby utrzymać aktywność i stabilność polimerazy Taq DNA przez długi czas. Seks; 15%-20% gliceryna pomaga amplifikować około 2,5 kb lub dłuższe fragmenty DNA.
4. Liczba cykli konwencjonalnego PCR wynosi na ogół od 25 do 40 cykli. Ogólny błąd polega na tym, że liczba cykli jest zbyt duża, niespecyficzne tło jest poważne, a złożoność wzrasta. Oczywiście liczba cykli reakcji jest zbyt mała, a wydajność niska. Dlatego konieczne jest zapewnienie otrzymania produktu. Zgodnie z założeniem stawki, liczba cykli powinna być zminimalizowana.
Po zakończeniu amplifikacji próbkę schładza się i przechowuje w 4°C.
2. Projekt podkładu podkładowego
Aby amplifikować DNA matrycy, musisz najpierw zaprojektować dwa startery oligonukleotydowe. Tak zwane startery są w rzeczywistości dwoma fragmentami oligonukleotydów, które są komplementarne do docelowej sekwencji DNA, która ma być amplifikowana. Odległość między dwoma starterami określa długość amplifikowanego fragmentu. , Końce 5& #39 dwóch starterów określają pozycje dwóch końców 5& #39 amplifikowanego produktu. Można zauważyć, że startery są kluczem do określenia długości, pozycji i wyników fragmentów amplifikowanych metodą PCR, a projekt startera jest ważniejszy.
Warunkiem koniecznym do zaprojektowania startera jest to, że docelowa sekwencja DNA komplementarna do startera musi być znana. Sekwencja pomiędzy dwoma starterami niekoniecznie jest jasna. Dwie znane sekwencje mają na ogół 15-20 zasad, które można zsyntetyzować za pomocą syntezatora DNA. Odpowiadając dwóm uzupełniającym się starterom, zasady ogólnie stosowane przy projektowaniu starterów obejmują:
1. Długość startera oblicza się na podstawie statystyk, a prawdopodobieństwo, że sekwencja oligonukleotydowa o długości około 17 zasad może pojawić się w genomie człowieka wynosi jednorazowo. Dlatego długość startera wynosi na ogół nie mniej niż 16 nukleotydów, a najwyższa nie więcej niż 30 nukleotydów, a najlepsza długość to 20-24 nukleotydów. Takie krótkie oligonukleotydy nie utworzą stabilnej hybrydy w temperaturze polimeryzacji (przejście 72°C). Czasami może to być 5' Dodać na końcu sekwencje, które nie są komplementarne do matrycy, takie jak miejsca enzymów restrykcyjnych lub promotory, aby zakończyć klonowanie genów i inne specjalne potrzeby; starter 5' końcowy znacznik biotynowy lub znacznik fluorescencyjny można stosować do różnych celów, takich jak wykrywanie drobnoustrojów.
Czasami elementarz nie działa' przyczyna jest nieznana, możesz przesunąć pozycję, aby go rozwiązać.
2. Skład podkładów o zawartości (G+C)% powinien być jednorodny i należy unikać stosowania tego samego polimeru bazowego. Zawartość (G+C)% w dwóch starterach powinna być jak najbardziej podobna, w znanym amplifikowanym fragmencie (G+C)% Zawartość powinna być zbliżona do amplifikowanego fragmentu, ogólnie 40% do 60% jest lepsze.
3. Wnętrze podkładu powinno unikać tworzenia oczywistych struktur drugorzędowych, zwłaszcza struktur spinek do włosów. Na przykład:
4. Nie powinno być komplementacji pomiędzy dwoma starterami pomiędzy starterami, zwłaszcza na końcu 3' startera. Nawet jeśli nie można tego uniknąć, zasada komplementarna na końcu 3& #39; nie powinna być większa niż 2 zasady, w przeciwnym razie łatwo jest utworzyć&„dimer startera &”; Lub"Primer dimer" (podkład dimera). Tak zwany dimer startera jest zasadniczo dwuniciowym fragmentem DNA utworzonym przez wydłużenie jednego startera na drugiej sekwencji startera pod działaniem polimerazy DNA. , Jest powszechnym produktem ubocznym PCR, a czasem nawet staje się głównym produktem.
Ponadto należy unikać sekwencji homologicznych między dwoma starterami, zwłaszcza fragmentów oligonukleotydów z więcej niż 6 kolejnymi identycznymi zasadami, w przeciwnym razie dwa startery będą współzawodniczyć ze sobą o to samo miejsce na matrycy; podobnie, startery i docelowy DNA do amplifikacji Lub inne sekwencje próbki DNA nie mogą mieć sekwencji homologicznych zawierających więcej niż 6 zasad. W przeciwnym razie startery zwiążą się z innymi miejscami, zmniejszając swoistą amplifikację i zwiększając nieswoistą amplifikację.
5. Polimeraza DNA parująca koniec 3' dodaje pojedynczy nukleotyd do końca 3' startera. Dlatego wymagania dotyczące parowania 5-6 zasad z końca 3& #39 startera i docelowego DNA muszą być precyzyjne i ścisłe, aby zapewnić skuteczną amplifikację PCR. .
To, czy projekt startera jest rozsądny, można zweryfikować, przeszukując komputer przy użyciu oprogramowania PCRDESN i amerykańskiego oprogramowania PRIMER.
Sztucznie zsyntetyzowane oligonukleotydy powinny być korzystnie oczyszczone przez chromatografię (chromatografię) lub PAGE w celu usunięcia zanieczyszczeń, takich jak krótkie łańcuchy, które nie zostały zsyntetyzowane do pełnej długości. Oczyszczone startery przechowywane w 25% roztworze acetonitrylu w temperaturze 4°C mogą zapobiegać rozwojowi mikroorganizmów W normalnych warunkach nieużywane startery należy przechowywać w lodówce w temperaturze -20°C. Startery mogą być przechowywane w płynie przez 6 miesięcy, a po liofilizacji mogą być przechowywane przez 1 do 2 lat.
