Technologia PCR jest podobna do naturalnego procesu replikacji DNA, a jej specyficzność opiera się na starterach oligonukleotydowych komplementarnych do obu końców sekwencji docelowej. PCR składa się z trzech podstawowych etapów reakcji: denaturacji, przyłączania i wydłużania. Ten proces reakcji jest przeprowadzany w pojemniku reakcyjnym PCR. Wraz z ciągłym rozwojem instrumentu do amplifikacji genów pojemnik reakcyjny również doświadczył stopniowego rozwoju probówki wirówkowej z 1,5 ml do 0,2 ml (0,25 ml) do cienkościennej {{ 7}}.2ml dedykowane do PCR. , 0.1mlpcr probówka. Wraz ze wzrostem liczby reakcji amplifikacji PCR stopniowo powstają wysokowydajne pojemniki do amplifikacji genów na paski i płytki PCR.
PCR składa się z trzech podstawowych etapów reakcji: denaturacja-annealing-przedłużenie
Denaturacja matrycowego DNA:
Po podgrzaniu matrycy DNA do około 94 stopni przez pewien czas, dwuniciowy DNA matrycy lub dwuniciowy DNA utworzony przez amplifikację PCR jest dysocjowany, tak aby można go było połączyć ze starterem w celu przygotowania do następnej rundy reakcji.
Wyżarzanie (renaturacja) matrycowego DNA za pomocą starterów:
Po zdenaturowaniu matrycy DNA w pojedynczą nić przez ogrzewanie i obniżeniu temperatury do około 55 stopni, startery są sparowane z sekwencją komplementarną pojedynczej nici matrycy DNA.
Przedłużenie podkładów:
Pod działaniem Taq koniugat DNA matryca-starter wykorzystuje dNTP jako surowiec reakcyjny do syntezy nowego pół-zarezerwowanego łańcucha replikacji, komplementarnego do matrycowego łańcucha DNA, zgodnie z zasadą parowania zasad i pół-zarezerwowanej replikacji.
Podstawowe zasady technologii PCR
Technologia opiera się na enzymatycznej reakcji syntezy polimerazy DNA w obecności matrycy DNA, starterów i czterech dezoksyrybonukleotydów.
Polimeraza DNA wykorzystuje jednoniciowy DNA jako matrycę do zainicjowania syntezy z małym kawałkiem dwuniciowego DNA. Jeden lub dwa syntetyczne startery oligonukleotydowe są łączone z sekwencją komplementarną w matrycy jednoniciowego DNA, aby utworzyć częściowy dwuniciowy DNA.
W odpowiedniej temperaturze i środowisku, polimeraza DNA dodaje deoksymononukleotyd do końca 3'-OH startera i wykorzystuje go jako punkt wyjścia do rozciągania się wzdłuż kierunku 5'→3' matrycy w celu zsyntetyzowania nowej komplementarnej nici DNA.
Różnica między probówkami do PCR a probówkami wirówkowymi
Probówki do PCR:
Płytka reakcyjna PCR ma 96-dołek lub 384-dołek, który jest specjalnie zaprojektowany do reakcji wsadowych. Zasada jest taka, że przepustowość maszyny PCR i sekwensera wynosi na ogół 96 lub 384.
Probówka wirówkowa:
Probówka wirówkowa niekoniecznie musi być probówką do PCR. Istnieje wiele rodzajów probówek wirówkowych w zależności od ich pojemności. Najczęściej używane to 1,5ml, 2ml, 5ml, 15 lub 50ml, a najmniejsza (250ul) może służyć jako probówka do PCR.
Jak wybrać probówki do PCR
Zdecydowaliśmy się na umieszczenie probówek do PCR w nadziei wybrania najdokładniejszej lokalizacji dla temperatury.
Najdokładniejsze położenie temperatury powinno być położeniem nad czujnikiem temperatury pod modułem (niezależnie od niedokładnej temperatury czujnika).
Pozycja czujnika temperatury w różnych przyrządach do PCR jest inna.
Na przykład, AB 2720 ma tylko jeden pośrodku, MJ 200 ma trzy czujniki, lewy dolny, środkowy i prawy górny, Eppendorf powinien znajdować się w rzędzie A lub H, a Dongshenglong 811 ma trzy czujniki temperatury, B{{3} } należy wybrać , C1-2, C6-7, D6-7, B11-12, C11-12, ponieważ te punkty są punktami temperaturowymi.
