1. Na płytce hodowlanej namoczyć szkiełka, które zostały przesunięte w PBS trzy razy przez 3 minuty za każdym razem.
2. Utrwalić szkiełka 4-procentowym paraformaldehydem przez 15 minut i zanurzyć szkiełka w PBS 3 razy, za każdym razem na 3 minuty.
3. Permeabilizuj 0,5% Tritonem X-100 (przygotowanym w PBS) przez 20 minut w temperaturze pokojowej (w przypadku antygenów ulegających ekspresji na błonie komórkowej etap ten pomija się).
4. Blokowanie surowicy: zanurzyć szkiełka w PBS 3 razy na 3 minuty za każdym razem, wysuszyć PBS bibułą, dodać normalną kozią surowicę (pod warunkiem, że źródłem drugorzędowych przeciwciał jest koza) na szkiełka i blokować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
5. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało: Wchłonąć roztwór blokujący bibułą, nie myć, dodać odpowiednią ilość rozcieńczonego pierwszorzędowego przeciwciała do każdego szkiełka i umieścić je w mokrym pudełku, inkubować w 4 stopniach przez noc.
6. Dodać drugorzędowe przeciwciało fluorescencyjne: zanurzyć szkiełka w PBST 3 razy, każdorazowo na 3 minuty, nadmiar płynu na szkiełkach wchłonąć bibułą, dodać kroplami rozcieńczone drugorzędowe przeciwciało fluorescencyjne, inkubować w 20-37 stopniach przez 1h w mokrym pudełku namocz plasterek PBST 3 razy, za każdym razem po 3 minuty.
Uwaga: Od momentu dodania drugorzędowego przeciwciała fluorescencyjnego wszystkie kolejne etapy należy przeprowadzać w miarę możliwości w ciemnym miejscu.
7. Blokowanie surowicy: osuszyć płyn bibułą, upuścić normalną kozią surowicę na szklane szkiełko (pod warunkiem, że źródłem drugorzędowych przeciwciał jest koza) i blokować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
8. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało: Zaabsorbować roztwór blokujący bibułą, nie myć, następnie dodać kroplami rozcieńczone pierwszorzędowe przeciwciało i inkubować przez noc w wilgotnym pojemniku o temperaturze 4 stopni w ciemności po dodaniu pierwszorzędowego przeciwciała. (Uwaga: gatunek drugiego przeciwciała pierwszorzędowego różni się od gatunku pierwszego przeciwciała pierwszorzędowego, takiego jak mysz i królik)
9. Dodać drugorzędowe przeciwciało fluorescencyjne: zanurzyć szkiełka w PBST 3 razy, za każdym razem na 3 minuty, nadmiar płynu na szkiełkach absorbować bibułą, dodać kroplami rozcieńczone drugorzędowe przeciwciało fluorescencyjne, inkubować w 20-37 stopniach przez 1h w mokrym pudełku namoczyć w PBST Slice 3 razy, za każdym razem po 3 minuty. (Uwaga: jeśli do wykrywania pierwszego przeciwciała wybrano czerwoną fluorescencję, drugie musi wybrać inne kolory fluorescencji)
10. Barwienie kontrastujące jąder: wkroplono DAPI i inkubowano w ciemności przez 5 minut, próbki barwiono, a nadmiar DAPI wypłukano PBST 5 min x 4 razy.
11. Wysuszyć płyn na szkiełku papierem chłonnym, uszczelnić szkiełko płynem zamykającym zawierającym wygaszacz antyfluorescencyjny i obserwować i zbierać obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym.
