Zasada PCR polega na użyciu DNA, które ulega denaturacji i staje się jednoniciowe w wysokiej temperaturze 95°C in vitro. W niskich temperaturach (zwykle około 60°C) startery i pojedyncze nici łączy się zgodnie z zasadą komplementarnego parowania zasad, a następnie temperaturę dostosowuje się do polimerazy DNA. W optymalnej temperaturze reakcji (około 72°C), polimeraza DNA syntetyzuje komplementarne nici wzdłuż kierunku od kwasu fosforowego do pięciu cukrów węglowych (5'-3').
Najcenniejszym obszarem zastosowania PCR jest diagnostyka chorób zakaźnych. Teoretycznie, dopóki w próbce znajduje się patogen, można wykryć reakcję PCR.
W eksperymentach odkryto, że DNA można również denaturować i topić w wysokich temperaturach, a po obniżeniu temperatury można go ponownie renaturować w podwójne nici. Dlatego też, kontrolując denaturację i renaturację DNA przez zmiany temperatury, dodanie starterów projektowych, polimerazy DNA i dNTP może zakończyć replikację określonych genów in vitro.
Jednak polimeraza DNA zostanie inaktywowana w wysokich temperaturach. Dlatego w każdym cyklu trzeba dodawać nową polimerazę DNA, co jest nie tylko uciążliwe w obsłudze, ale także kosztowne, co ogranicza zastosowanie i rozwój technologii PCR.